Hevosarteriitti viruksen Real Time RT-PCR -menetelmän käyttöönotto ja validointi
Moisanen, Henri (2016)
Moisanen, Henri
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2016
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2016112216869
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2016112216869
Tiivistelmä
Opinnäytetyö suoritettiin Eläintautivirologian tutkimusyksikössä Elintarviketurvallisuusviras-to Evirassa. Työn tavoitteena oli ottaa käyttöön ja validoida reaali-aikainen RT-PCR-menetelmä (rRT-PCR) hevosen arteriittivirukselle (equine arteritis virus, EAV) käytössä olevan perinteisen RT-PCR-menetelmän tilalle. Nykyaikainen rRT-PCR-menetelmä vähen-täisi työvaiheita ja nopeuttaisi diagnostiikkaa.
Validointia varten valmistettiin laimennossarjoja arteriittiviruskannoista Arvac ja Bucyrus eri matriiseihin. Lisäksi validoinnissa käytettiin vuosien 2009, 2013 ja 2016 EU-referenssilaboratorion toimittamia vertailumittausnäytteitä. Ensimmäiseksi testattiin mene-telmän toimivuus CFX-96™ Real Time PCR -laitteella, sekä varmistettiin DNA-sekvensointitekniikalla, että monistettava kohta on oikeaa viruksen genomista aluetta.
Laimennossarjoista saatiin laskettua variaatiokerroin (CV), joka kertoo tulosten uusittavuu-desta ja toistettavuudesta. Vuosien 2009, 2013 ja 2016 vertailumittausnäytteistä menetel-mällä saatiin yhtenevät tulokset referenssilaboratorion tulosten kanssa.
Sekvensoinnin tulokset olivat selkeitä vaikkakin PCR-tuotteen pituus on vain 204 emäspa-rin mittainen, mikä voi aiheuttaa ongelmia sekvensoinnissa. Menetelmällä saadaan monis-tettua oikeaa kohtaa viruksen genomista (ORF7). Laimennossarjojen avulla laskettu variaa-tiokerroin oli hyvä. Suurilla laimennoksilla tulos heikkeni, sillä viruksen RNA:n vähentyessä näytteessä myös todennäköisyys PCR-reaktion onnistumiselle pienenee.
Evira on FINAS-akkreditoitu testauslaboratorio ja tässä työssä validoitu menetelmä tullaan liittämään osaksi Eläintautivirologian tutkimusyksikössä käytössä olevia akkreditoituja diag-nostisia PCR-menetelmiä.
Validointia varten valmistettiin laimennossarjoja arteriittiviruskannoista Arvac ja Bucyrus eri matriiseihin. Lisäksi validoinnissa käytettiin vuosien 2009, 2013 ja 2016 EU-referenssilaboratorion toimittamia vertailumittausnäytteitä. Ensimmäiseksi testattiin mene-telmän toimivuus CFX-96™ Real Time PCR -laitteella, sekä varmistettiin DNA-sekvensointitekniikalla, että monistettava kohta on oikeaa viruksen genomista aluetta.
Laimennossarjoista saatiin laskettua variaatiokerroin (CV), joka kertoo tulosten uusittavuu-desta ja toistettavuudesta. Vuosien 2009, 2013 ja 2016 vertailumittausnäytteistä menetel-mällä saatiin yhtenevät tulokset referenssilaboratorion tulosten kanssa.
Sekvensoinnin tulokset olivat selkeitä vaikkakin PCR-tuotteen pituus on vain 204 emäspa-rin mittainen, mikä voi aiheuttaa ongelmia sekvensoinnissa. Menetelmällä saadaan monis-tettua oikeaa kohtaa viruksen genomista (ORF7). Laimennossarjojen avulla laskettu variaa-tiokerroin oli hyvä. Suurilla laimennoksilla tulos heikkeni, sillä viruksen RNA:n vähentyessä näytteessä myös todennäköisyys PCR-reaktion onnistumiselle pienenee.
Evira on FINAS-akkreditoitu testauslaboratorio ja tässä työssä validoitu menetelmä tullaan liittämään osaksi Eläintautivirologian tutkimusyksikössä käytössä olevia akkreditoituja diag-nostisia PCR-menetelmiä.