Gremlinin vasta-aineiden tuotto ja karakterisointi
Kiiskinen, Topias (2016)
Kiiskinen, Topias
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2016
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2016112817934
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2016112817934
Tiivistelmä
Keuhkofibroosi ja mesoteliooma ovat sairauksia, joilla on huono ennuste eikä tehokasta hoitoa. Keuhkofibroosissa keuhkot hiljalleen arpeutuvat, mikä johtaa hapenottokyvyn heikkenemiseen. Elinikäennuste on yleensä noin 3–5 vuotta. Mesoteliooma on enimmäkseen keuhkopussissa esiintyvä aggressiivinen syöpä, jota esiintyy eniten asbestialtistuksen seurauksena. Sen keskimääräinen elinikäennuste on 1–2 vuotta.
BMP-kasvutekijöiden aktiivisuuden häiriöitä on todettu esiintyvän molempien sairauksien yhteydessä. Yhdeksi syyksi näihin häiriöihin on todettu BMP-antagonisti Gremlinin liiallinen esiintyminen. Normaalisti toimiessaan BMP ehkäisee useiden sairauksien syntyä sekä tasapainottaa TGF-β-kasvutekijöiden esiintymistä. Matalan BMP-aktiivisuuden yhteydessä TGF-β-aktiivisuus on yleensä huomattavasti koholla. Liiallinen aktiivisuus estää hyvänlaatuisten solujen kasvua, ja syöpäsolut voivat menettää herkkyytensä TGF-β:lle.
Työn tavoitteena oli löytää potentiaalisia vasta-aineita, jotka estäisivät Gremlinin toiminnan ja näin palauttaisivat BMP:n aktiivisuuden normaalille tasolle. BMP-aktiivisuuden palauttaminen saattaisi toimia hoitokeinona mesotelioomalle ja keuhkofibroosille.
Vasta-aineet kasvatettiin esiseulotuissa scFv-AP-vasta-aineita tuottavista Escherichia colibakteereista ja puhdistettiin Ni-NTA-kolonneilla. Puhdistuksen onnistumista arvioitiin western blot -menetelmällä, sekä vasta-aineiden pitoisuudet määritettiin myöhempiä kokeita varten. Vasta-aineiden kykyä sitoa Gremliniä ja niiden spesifisyyttä testattiin suorilla ja sandwich ELISA-testeillä. Sitoutumista kokeiltiin kahteen eri Gremliniin, Gremlin-1:een ja Gremlin-2:een. Kykyä estää Gremlinin toimintaa testattiin dual lusiferaasi -reportterikokeilla. Kokeissa testattiin vain vasta-aineiden Gremlin-1:n estokykyä, koska ELISA-kokeissa todettiin, että vasta-aineet eivät sitoutuneet mainittavasti Gremlin-2:een.
ELISA-kokeissa useamman testatun vasta-aineen todettiin sitoutuvan Gremlin-1:een. Dual lusiferaasi-kokeissa ainoastaan yksi näyte osoitti estävänsä Gremlinin toimintaa hyvin kaikilla testatuilla pitoisuuksilla. Näin ollen voidaan todeta kokeiden avulla löytyneen ainakin yksi potentiaalinen Gremlin-1 vasta-aine, jota voidaan lähteä tutkimaan tarkemmin.
BMP-kasvutekijöiden aktiivisuuden häiriöitä on todettu esiintyvän molempien sairauksien yhteydessä. Yhdeksi syyksi näihin häiriöihin on todettu BMP-antagonisti Gremlinin liiallinen esiintyminen. Normaalisti toimiessaan BMP ehkäisee useiden sairauksien syntyä sekä tasapainottaa TGF-β-kasvutekijöiden esiintymistä. Matalan BMP-aktiivisuuden yhteydessä TGF-β-aktiivisuus on yleensä huomattavasti koholla. Liiallinen aktiivisuus estää hyvänlaatuisten solujen kasvua, ja syöpäsolut voivat menettää herkkyytensä TGF-β:lle.
Työn tavoitteena oli löytää potentiaalisia vasta-aineita, jotka estäisivät Gremlinin toiminnan ja näin palauttaisivat BMP:n aktiivisuuden normaalille tasolle. BMP-aktiivisuuden palauttaminen saattaisi toimia hoitokeinona mesotelioomalle ja keuhkofibroosille.
Vasta-aineet kasvatettiin esiseulotuissa scFv-AP-vasta-aineita tuottavista Escherichia colibakteereista ja puhdistettiin Ni-NTA-kolonneilla. Puhdistuksen onnistumista arvioitiin western blot -menetelmällä, sekä vasta-aineiden pitoisuudet määritettiin myöhempiä kokeita varten. Vasta-aineiden kykyä sitoa Gremliniä ja niiden spesifisyyttä testattiin suorilla ja sandwich ELISA-testeillä. Sitoutumista kokeiltiin kahteen eri Gremliniin, Gremlin-1:een ja Gremlin-2:een. Kykyä estää Gremlinin toimintaa testattiin dual lusiferaasi -reportterikokeilla. Kokeissa testattiin vain vasta-aineiden Gremlin-1:n estokykyä, koska ELISA-kokeissa todettiin, että vasta-aineet eivät sitoutuneet mainittavasti Gremlin-2:een.
ELISA-kokeissa useamman testatun vasta-aineen todettiin sitoutuvan Gremlin-1:een. Dual lusiferaasi-kokeissa ainoastaan yksi näyte osoitti estävänsä Gremlinin toimintaa hyvin kaikilla testatuilla pitoisuuksilla. Näin ollen voidaan todeta kokeiden avulla löytyneen ainakin yksi potentiaalinen Gremlin-1 vasta-aine, jota voidaan lähteä tutkimaan tarkemmin.