Yersinia pseudotuberculosis serotyyppi O:9 lipopolysakkaridin O-antigeenin biosynteesiä ohjaavan geeniklusterin kloonaaminen ja sekvensointi
Kasanen, Tiina (2008)
Kasanen, Tiina
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2008
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-200811264123
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-200811264123
Tiivistelmä
Yersinia pseudotuberculosis on gramnegatiivinen bakteeri, jonka soluseinässä oleva ulkomembraani koostuu pääosin lipopolysakkaridista sekä fosfolipideistä ja proteiineista. Lipopolysakkaridi on tärkeä antigeeninen rakenne, joka koostuu lipidi A:sta, ydinoligosakkaridista sekä O-polysakkaridista eli O-antigeenista. O-antigeenisen osan rakenne vaihtelee hyvin paljon eri bakteereilla ja samankin bakteerilajin eri kannoilla, mihin perustuu bakteerikantojen
jako eri serotyyppeihin.
Tutkimuksen kohteena oli Yersinia pseudotuberculosis serotyypin O:9 lipopolysakkaridin O-antigeenin biosynteesiä ohjaavan geeniklusterin kloonaaminen ja sekvensointi. Kloonausvektorina käytettiin kosmidia, jolloin puhutaan kosmidikloonauksesta. Lyhyesti kuvattuna tämä tehtiin seuraavasti: Yersinia pseudotuberculosis O:9 genominen DNA digestoitiin Sau3AI-restriktioentsyymillä ja kosmidi pHC79 BamHI:llä. Tuotteet ligoitiin, pakattiin in vitro lambda-faagiin ja transduktoitiin E. coli LE 392 -soluihin.
Kosmidikirjaston valmistuttua se seulottiin. Geeniklusterin geeneistä wzz-geenin sekvenssi on tiedossa, mikä on mahdollistanut spesifisen PCR- eli polymeraasiketjureaktiomenetelmän kehittämisen geeniklusterin identifioimiseksi. wzz-positiivisten kloonien sisältämät
kosmidit eristettiin ja kosmidien inserttien ääripäät sekvensoitiin.
Sekvensoinnista saatuja tuloksia verrattiin geenipankin Yersinia pseudotuberculosis -kantojen DNA-sekvensseihin ja varsin ajoissa heräsi epäilys siitä, että insertit sisältävät
monta lyhyttä Sau3AI-digestiotuotetta, jotka ovat ligoituneet toisiinsa.
Kosmidikirjasto tehtiin uudelleen. Suuri määrä genomista DNA:ta digestoitiin partiaalisesti ja tällä kertaa lyhyet Sau3AI-digestiotuotteet poistettiin sokerigradienttiajolla. Saadut pitkät genomiset DNA-fragmentit ligoitiin kosmidiin, pakattiin ja transduktoitiin E. coliin. Tämän seurauksena saatiin yli 20000 kloonin kosmidikirjasto. Positiivisten kloonien seulonta tulee olemaan seuraava tehtävä tässä projektissa.
jako eri serotyyppeihin.
Tutkimuksen kohteena oli Yersinia pseudotuberculosis serotyypin O:9 lipopolysakkaridin O-antigeenin biosynteesiä ohjaavan geeniklusterin kloonaaminen ja sekvensointi. Kloonausvektorina käytettiin kosmidia, jolloin puhutaan kosmidikloonauksesta. Lyhyesti kuvattuna tämä tehtiin seuraavasti: Yersinia pseudotuberculosis O:9 genominen DNA digestoitiin Sau3AI-restriktioentsyymillä ja kosmidi pHC79 BamHI:llä. Tuotteet ligoitiin, pakattiin in vitro lambda-faagiin ja transduktoitiin E. coli LE 392 -soluihin.
Kosmidikirjaston valmistuttua se seulottiin. Geeniklusterin geeneistä wzz-geenin sekvenssi on tiedossa, mikä on mahdollistanut spesifisen PCR- eli polymeraasiketjureaktiomenetelmän kehittämisen geeniklusterin identifioimiseksi. wzz-positiivisten kloonien sisältämät
kosmidit eristettiin ja kosmidien inserttien ääripäät sekvensoitiin.
Sekvensoinnista saatuja tuloksia verrattiin geenipankin Yersinia pseudotuberculosis -kantojen DNA-sekvensseihin ja varsin ajoissa heräsi epäilys siitä, että insertit sisältävät
monta lyhyttä Sau3AI-digestiotuotetta, jotka ovat ligoituneet toisiinsa.
Kosmidikirjasto tehtiin uudelleen. Suuri määrä genomista DNA:ta digestoitiin partiaalisesti ja tällä kertaa lyhyet Sau3AI-digestiotuotteet poistettiin sokerigradienttiajolla. Saadut pitkät genomiset DNA-fragmentit ligoitiin kosmidiin, pakattiin ja transduktoitiin E. coliin. Tämän seurauksena saatiin yli 20000 kloonin kosmidikirjasto. Positiivisten kloonien seulonta tulee olemaan seuraava tehtävä tässä projektissa.