Herpesvirusinfektioissa erittyvien eksosomien puhdistuksen optimointi ja niiden karakterisointi
Leimu, Salli (2017)
Leimu, Salli
Turun ammattikorkeakoulu
2017
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201705249951
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201705249951
Tiivistelmä
Eksosomit ovat solujen erittämiä kalvopäällysteisiä vesikkeleitä, jotka kuljettavat erilaisia proteiineja ulos soluista. Ne voivat kulkeutua veren mukana muualle elimistöön infektoituneelta alueelta, jolloin ne saattavat joko edistää tai hidastaa infektion leviämistä. Eksosomit saattavat antaa muille terveille soluille varoitussignaaleja reseptoriensa kautta, jolloin ne voisivat käynnistää immuunipuolustusvasteen. Jos näin olisi, eksosomit estäisivät infektion leviämistä. Toinen mahdollisuus on, että virukset kulkeutuvat eksosomien sisällä veren mukana elimistöön aiheuttaen tulehduksen muualle kudokseen. Infektion aikana erittyneet eksosomit saattavat sisältää informaatiota infektion leviämisestä kudoksessa. Niiden sisältämät proteiinit ovat peräisin infektoituneista soluista, jolloin solut ovat käyttäneet eksosomeja ”roskakuskeinaan”. Eristetyistä infektion aikana muodostuneista eksosomeista voidaan tutkia niiden roolia HSV-1-virusinfektioissa.
Eksosomien ja HSV-1 eli Herpes Simplex tyypin 1 viruksien erottaminen toisistaan voimakkaan sentrifugoinnin jälkeen on haastavaa, ehkä jopa mahdotonta. Tätä tukee aikaisempi tutkimus, jossa eksosomeja ja viruksia ei aluksi saatu erilleen. Eksosomit aiheuttavat kontaminaation virusvalmisteita valmistettaessa viruspuhdistuksen yhteydessä. Viruspuhdistuksessa virukset erotetaan suodatuksilla ja sentrifugoimalla. Eksosomit ja HSV-1-virukset ovat lähes samankokoisia, jolloin ne eivät erotu kokoon perustuvassa suodatuksessa. Lisäksi molemmilla on kalvomainen ulkokuori, jolloin niiden painautuessa toisiinsa sentrifugoinnissa ne saattavat tarttua toistensa membraaneihin kiinni.
Virusvalmisteita käytetään muun muassa tutkimuskäyttöön ja niiden kontaminoituminen saattaa olla suuri riski tutkimuksen onnistumiselle. Eksosomien sisällä voi kulkeutua erilaisia proteiineja tai jopa viruksen proteiineja. Tutkimukseen kuulumattomien proteiinien vapautuminen eksosomeista saattaa antaa virheellisiä tuloksia. Varmempien tutkimustulosten, sekä virusdiagnostiikan parantamiseksi tulisi ensisijaisesti valmistaa puhtaita virusvalmisteita.
Eksosomit ja HSV-1-virukset erotettiin kasvatusmediumista, HSV-1-infektoitujen solujen päältä. Eksosomien ja HSV-1 virusten erottamiseen toisistaan kokeiltiin ensin kaupallista eksosomien eristysreagenssia. Tämä menetelmä todettiin huonoksi ja samalla huomattiin, että HSV-1-virukset ja eksosomit saattavat olla kiinni toisissaan. Menetelmää piti muuttaa niin, ettei viruksia ja eksosomeja painettaisi tiiviisti yhteen missään puhdistusvaiheessa. Puhdistusmenetelmän optimoinnin tuloksena HSV-1-virukset ja eksosomit saatiin erotettua toisistaan soveltamalla perinteistä viruspuhdistusta eksosomien erottamiseen näytteestä. Lopullisena puhdistusmenetelmänä käytettiin tiheysgradienttisetrifugointia, jolla partikkelit saatiin erotettua toisistaan kokonsa ja molekyylipainonsa mukaan.
Eksosomien ja HSV-1 eli Herpes Simplex tyypin 1 viruksien erottaminen toisistaan voimakkaan sentrifugoinnin jälkeen on haastavaa, ehkä jopa mahdotonta. Tätä tukee aikaisempi tutkimus, jossa eksosomeja ja viruksia ei aluksi saatu erilleen. Eksosomit aiheuttavat kontaminaation virusvalmisteita valmistettaessa viruspuhdistuksen yhteydessä. Viruspuhdistuksessa virukset erotetaan suodatuksilla ja sentrifugoimalla. Eksosomit ja HSV-1-virukset ovat lähes samankokoisia, jolloin ne eivät erotu kokoon perustuvassa suodatuksessa. Lisäksi molemmilla on kalvomainen ulkokuori, jolloin niiden painautuessa toisiinsa sentrifugoinnissa ne saattavat tarttua toistensa membraaneihin kiinni.
Virusvalmisteita käytetään muun muassa tutkimuskäyttöön ja niiden kontaminoituminen saattaa olla suuri riski tutkimuksen onnistumiselle. Eksosomien sisällä voi kulkeutua erilaisia proteiineja tai jopa viruksen proteiineja. Tutkimukseen kuulumattomien proteiinien vapautuminen eksosomeista saattaa antaa virheellisiä tuloksia. Varmempien tutkimustulosten, sekä virusdiagnostiikan parantamiseksi tulisi ensisijaisesti valmistaa puhtaita virusvalmisteita.
Eksosomit ja HSV-1-virukset erotettiin kasvatusmediumista, HSV-1-infektoitujen solujen päältä. Eksosomien ja HSV-1 virusten erottamiseen toisistaan kokeiltiin ensin kaupallista eksosomien eristysreagenssia. Tämä menetelmä todettiin huonoksi ja samalla huomattiin, että HSV-1-virukset ja eksosomit saattavat olla kiinni toisissaan. Menetelmää piti muuttaa niin, ettei viruksia ja eksosomeja painettaisi tiiviisti yhteen missään puhdistusvaiheessa. Puhdistusmenetelmän optimoinnin tuloksena HSV-1-virukset ja eksosomit saatiin erotettua toisistaan soveltamalla perinteistä viruspuhdistusta eksosomien erottamiseen näytteestä. Lopullisena puhdistusmenetelmänä käytettiin tiheysgradienttisetrifugointia, jolla partikkelit saatiin erotettua toisistaan kokonsa ja molekyylipainonsa mukaan.