Ihmisen neutraalin a-mannosidaasin tuottaminen Leishmania tarentolae -alkueläimessä
Sihvo, Sanna (2010)
Sihvo, Sanna
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2010
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2010113016311
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2010113016311
Tiivistelmä
Tässä opinnäytetyössä oli tarkoitus tuottaa glykosidihydrolaaseihin kuuluvaa ihmisen neutraalia α-mannosidaasia (NAM) Leishmania tarentolae -alkueläimessä myöhemmin tehtävää proteiinipuhdistusta, kiteytystä ja edelleen rakennetutkimusta varten.
Työssä käytettiin LEXSY-tuottomenetelmää, joka perustuu rekombinanttiproteiinien tuottoon ihmiselle vaarattomassa alkueläimessä, liskojen parasiitissa, Leishmania tarentolaessa. Leishmania tarentolae -soluissa oli tarkoitus tuottaa sekä erittyvää että solunsisäistä ihmisen NAM:a, jonka kolmiulotteista rakennetta ei vielä tunneta. NAM kuuluu glykosidihydrolaaseihin, joilla on tärkeä merkitys väärin laskostuneiden proteiinien sokeriosien hajottamisessa.
Aikaisemman laboratoriotyön aikana oli kloonattu ihmisen NAM-geeni ekspressiovektoreihin PCR-reaktioilla. Tämä työ alkoi Escherichia coli -transformaatiolla, jossa tuotettiin erittyvää ja solunsisäistä proteiinituottoa varten kloonattuja ekspressiovektoreita sisältävää DNA:ta. Tämän jälkeen DNA:t puhdistettiin ja digestoitiin, jotta E. colissa tuottoon tarvittava osa saatiin poistettua. Digestoidut DNA:t konsentroitiin etanolisaostuksella ennen Leishmania tarentolae -solujen transfektioita, jotka suoritettiin elektroporaatiolla.
Transfektion jälkeen seurattiin erittyvän ja solunsisäisen NAM:n aktiivisuuksia solukasvatuksissa aktiivisuusmittauksilla. Solunsisäinen NAM tuottui aktiivisena mutta erittyvän NAM:in aktiivisuus laski nopeasti eikä sen pidempiaikainen tuotto siis onnistunut. Myöhemmin tehtävää proteiinipuhdistusta varten optimoitiin myös soluhajotusta, jolla solunsisäinen NAM-proteiini saataisiin vapautettua tehokkaasti solujen kasvatusliuokseen.
Tämän työn jälkeen solunsisäistä NAM:ia tuotettiin lisää tilavuudeltaan suuremmissa solukasvatuksissa ja kokeiltiin eri menetelmiä sen puhdistamiseksi.
Työssä käytettiin LEXSY-tuottomenetelmää, joka perustuu rekombinanttiproteiinien tuottoon ihmiselle vaarattomassa alkueläimessä, liskojen parasiitissa, Leishmania tarentolaessa. Leishmania tarentolae -soluissa oli tarkoitus tuottaa sekä erittyvää että solunsisäistä ihmisen NAM:a, jonka kolmiulotteista rakennetta ei vielä tunneta. NAM kuuluu glykosidihydrolaaseihin, joilla on tärkeä merkitys väärin laskostuneiden proteiinien sokeriosien hajottamisessa.
Aikaisemman laboratoriotyön aikana oli kloonattu ihmisen NAM-geeni ekspressiovektoreihin PCR-reaktioilla. Tämä työ alkoi Escherichia coli -transformaatiolla, jossa tuotettiin erittyvää ja solunsisäistä proteiinituottoa varten kloonattuja ekspressiovektoreita sisältävää DNA:ta. Tämän jälkeen DNA:t puhdistettiin ja digestoitiin, jotta E. colissa tuottoon tarvittava osa saatiin poistettua. Digestoidut DNA:t konsentroitiin etanolisaostuksella ennen Leishmania tarentolae -solujen transfektioita, jotka suoritettiin elektroporaatiolla.
Transfektion jälkeen seurattiin erittyvän ja solunsisäisen NAM:n aktiivisuuksia solukasvatuksissa aktiivisuusmittauksilla. Solunsisäinen NAM tuottui aktiivisena mutta erittyvän NAM:in aktiivisuus laski nopeasti eikä sen pidempiaikainen tuotto siis onnistunut. Myöhemmin tehtävää proteiinipuhdistusta varten optimoitiin myös soluhajotusta, jolla solunsisäinen NAM-proteiini saataisiin vapautettua tehokkaasti solujen kasvatusliuokseen.
Tämän työn jälkeen solunsisäistä NAM:ia tuotettiin lisää tilavuudeltaan suuremmissa solukasvatuksissa ja kokeiltiin eri menetelmiä sen puhdistamiseksi.