Theseus käyttökatko ma 22.4. klo 12 alkaen. Katko jatkuu 22.4. klo 15 asti ja on koko Theseuksen laajuinen. Lisäksi töiden käsittely ja syöttö on estetty ti 23.4. ainakin klo 12 asti. Theseus service break from Mon 22.4. at 12:00. The break will last until 15:00 on Mon 22.4. and is Theseus-wide. In addition, processing and uploading of work will be blocked until at least 12:00 on Tue 23.4.
Koko genomin monistamiseen tarkoitettujen kittien soveltuvuus alkiodiagnostiikkaan
Äikäs, Minna (2014)
Äikäs, Minna
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2014
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201405127360
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201405127360
Tiivistelmä
Ennen kuin alkio siirretään kohtuun IVF (in vitro fetrilization) -hoidossa, voidaan alkiodiagnostiikkaa tehdä niissä perheissä, joissa sikiöllä on riski saada vakava perinnöllinen sairaus tai periä balansoitu translokaatio ei-balansoidussa muodossa. Ennen tutkimusta tiedossa on oltava toisen tai molempien vanhempien kantama geenimutaatio/lokuksen alleelikoot tai rakenteellinen kromosomimuutos. Alkiodiagnostiikassa saadaan tutkittavaksi yleensä yksi tai kaksi blastomeerisolua. Tällä hetkellä alkiodiagnostiikassa käytetään FISH- tai PCR-menetelmiin perustuvia tutkimusmenetelmiä. Koko genomin monistaminen mahdollistaisi tulevaisuudessa uusien tutkimusmenetelmien, esimerkiksi array-CGH (molekyylikaryotyypitys) tai NGS (next generation sequencing) -menetelmän käyttöönoton. NGS-menetelmän avulla saadaan tietoa niin kromosomien rakenteellisista, määrällisistä kuin geenipoikkeavuuksista.
Opinnäytetyössä testattiin kahteen eri menetelmään perustuvia koko genomin monistamiseen tarkoitettuja kittejä. Lähdemateriaalina käytettiin alkion solujen lisäksi istukka-, iho- ja lapsivesinäytteistä saatuja soluja. Testattavina olivat Repli-g valmistajalta MDA (multiple displacement amplification) -tekniikkaan perustuvat Midi ja Single Cell -kitit, sekä New England Biolabs/Rubicon Genomics valmistajan PCR-monistamiseen perustuva Single Cell -kitti. Opinnäytetyössä haluttiin selvittää, voidaanko tutkimukseen valituilla kiteillä suorittaa koko genomin monistaminen onnistuneesti niin, että monistuksen tuloksena saadaan riittävästi ja riittävän puhdasta DNA:ta jatkotutkimuksiin, ja onko kittien suorituskyvyssä eroa esimerkiksi monistettavan DNA:n määrän, puhtauden tai fragmenttikoon suhteen.
Koko genomin monistamiseen tarkoitetuilla kiteillä onnistuttiin monistamaan sekä alkioiden että viljeltyjen kudosten DNA:ta kittien valmistajan lupaamien odotusarvojen suuntaisesti. Saavutettu DNA-määrä ja puhtausaste ovat riittäviä jatkotutkimuksiin. Ennakkoon tiedettiin, että koko genomin monistaminen muutamista soluista on erityisen altis kontaminaatiolle. Koko genomin monistamista ei tässäkään lyhytaikaisessa tutkimuksessa pystytty suorittamaan täysin ilman kontaminaatiota. Huolimatta mahdollisesta kontaminaatiosta, voidaan tulosten perusteella vetää johtopäätöksiä kittien eroista sekä monistuskyvystä. MDA-tekniikkaa käyttävä koko genomin monistaminen tuottaa suurempikokoista monistustuotetta kuin PCR-pohjainen monistaminen. Suuremman fragmenttikoon lisäksi se tuottaa sekä pitoisuudeltaan että puhtausasteeltaan parempaa monistustuotetta kuin PCR-menetelmällä monistettu DNA. Tulosten perusteella voidaan suositella, että jatkossa kannattaa käyttää Repli-g -kittejä solujen DNA:n monistamiseen niin array-CGH kuin NGS-tutkimuksia varten.
Opinnäytetyössä testattiin kahteen eri menetelmään perustuvia koko genomin monistamiseen tarkoitettuja kittejä. Lähdemateriaalina käytettiin alkion solujen lisäksi istukka-, iho- ja lapsivesinäytteistä saatuja soluja. Testattavina olivat Repli-g valmistajalta MDA (multiple displacement amplification) -tekniikkaan perustuvat Midi ja Single Cell -kitit, sekä New England Biolabs/Rubicon Genomics valmistajan PCR-monistamiseen perustuva Single Cell -kitti. Opinnäytetyössä haluttiin selvittää, voidaanko tutkimukseen valituilla kiteillä suorittaa koko genomin monistaminen onnistuneesti niin, että monistuksen tuloksena saadaan riittävästi ja riittävän puhdasta DNA:ta jatkotutkimuksiin, ja onko kittien suorituskyvyssä eroa esimerkiksi monistettavan DNA:n määrän, puhtauden tai fragmenttikoon suhteen.
Koko genomin monistamiseen tarkoitetuilla kiteillä onnistuttiin monistamaan sekä alkioiden että viljeltyjen kudosten DNA:ta kittien valmistajan lupaamien odotusarvojen suuntaisesti. Saavutettu DNA-määrä ja puhtausaste ovat riittäviä jatkotutkimuksiin. Ennakkoon tiedettiin, että koko genomin monistaminen muutamista soluista on erityisen altis kontaminaatiolle. Koko genomin monistamista ei tässäkään lyhytaikaisessa tutkimuksessa pystytty suorittamaan täysin ilman kontaminaatiota. Huolimatta mahdollisesta kontaminaatiosta, voidaan tulosten perusteella vetää johtopäätöksiä kittien eroista sekä monistuskyvystä. MDA-tekniikkaa käyttävä koko genomin monistaminen tuottaa suurempikokoista monistustuotetta kuin PCR-pohjainen monistaminen. Suuremman fragmenttikoon lisäksi se tuottaa sekä pitoisuudeltaan että puhtausasteeltaan parempaa monistustuotetta kuin PCR-menetelmällä monistettu DNA. Tulosten perusteella voidaan suositella, että jatkossa kannattaa käyttää Repli-g -kittejä solujen DNA:n monistamiseen niin array-CGH kuin NGS-tutkimuksia varten.