In situ ELISA-menetelmän optimointi TrkB-reseptorin fosforylaation mittaamiseksi primäärihermosoluviljelmissä
Kolehmainen, Sulo (2014)
Kolehmainen, Sulo
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2014
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2014111715790
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2014111715790
Tiivistelmä
Aivoperäinen hermokasvutekijä (BDNF) ja sen tyrosiinikinaasireseptori TrkB säätelevät keskeisellä tavalla hermosolujen erilaistumista, selviytymistä ja muovautuvuutta. Niiden signalointiin liittyvät häiriöt onkin liitetty monien mielialahäiriöiden patofysiologisiin mekanismeihin ja reseptorin on arveltu olevan keskeinen tekijä masennuslääkkeiden terapeuttisten vaikutusten välittämisessä.
Helsingin yliopiston Neurotieteen tutkimuskeskuksessa toteutetun opinnäytetyön tarkoituksena oli pystyttää in situ entsyymivälitteinen immunosorbenttimenetelmä (ELISA), jota voidaan hyödyntää TrkB-reseptorin fosforylaation mittaamiseksi primäärihermosoluviljelmistä. Kyseinen menetelmä on aikaisemmin pystytetty TrkB-reseptoria ilmentävälle fibroblastisolulinjalle, joka on joustavuudestaan huolimatta puutteellinen tutkimusväline keskushermostoon vaikuttavia lääkeaineita seulottaessa, sillä fibroblastit eroavat perustavanlaatuisesti primäärihermosoluista. Primäärihermosolut ovat kasvualustansa suhteen vaativampia kuin fibroblastit, ja tavoitteena oli löytää viljelyolosuhteet, joissa olisi mahdollista mitata BDNF:n aikaansaama TrkB-fosforylaatio ja joissa primäärihermosolut olisivat morfologialtaan normaaliolosuhteissa viljeltyjen hermosolujen kaltaiset.
Opinnäytetyön suorituksen aikana menetelmä saatiin toimimaan kohtalaisesti. Menetelmän signaali-kohina-suhdetta onnistuttiin terävöittämään pinnoittamiseen käytetyn poly-L-lysiinin konsentraatiota pienentämällä, pinnoitukselle herkkien vasta-aineiden vaihtamisella, sekä inkuboimalla primäärihermosoluja pidempiä aikoja, kuin pohjana käytetyn menetelmän fibroblasteja oli inkuboitu. Menetelmä on jo nykytilassaan hyödyllinen akateemisissa tutkimusprojekteissa ja menetelmän optimointi automatisoituun tutkimusympäristöön mahdollistaisi sen hyödyntämisen lääkeaineiden suurseulonnassa.
Helsingin yliopiston Neurotieteen tutkimuskeskuksessa toteutetun opinnäytetyön tarkoituksena oli pystyttää in situ entsyymivälitteinen immunosorbenttimenetelmä (ELISA), jota voidaan hyödyntää TrkB-reseptorin fosforylaation mittaamiseksi primäärihermosoluviljelmistä. Kyseinen menetelmä on aikaisemmin pystytetty TrkB-reseptoria ilmentävälle fibroblastisolulinjalle, joka on joustavuudestaan huolimatta puutteellinen tutkimusväline keskushermostoon vaikuttavia lääkeaineita seulottaessa, sillä fibroblastit eroavat perustavanlaatuisesti primäärihermosoluista. Primäärihermosolut ovat kasvualustansa suhteen vaativampia kuin fibroblastit, ja tavoitteena oli löytää viljelyolosuhteet, joissa olisi mahdollista mitata BDNF:n aikaansaama TrkB-fosforylaatio ja joissa primäärihermosolut olisivat morfologialtaan normaaliolosuhteissa viljeltyjen hermosolujen kaltaiset.
Opinnäytetyön suorituksen aikana menetelmä saatiin toimimaan kohtalaisesti. Menetelmän signaali-kohina-suhdetta onnistuttiin terävöittämään pinnoittamiseen käytetyn poly-L-lysiinin konsentraatiota pienentämällä, pinnoitukselle herkkien vasta-aineiden vaihtamisella, sekä inkuboimalla primäärihermosoluja pidempiä aikoja, kuin pohjana käytetyn menetelmän fibroblasteja oli inkuboitu. Menetelmä on jo nykytilassaan hyödyllinen akateemisissa tutkimusprojekteissa ja menetelmän optimointi automatisoituun tutkimusympäristöön mahdollistaisi sen hyödyntämisen lääkeaineiden suurseulonnassa.