Rapid Detection of Streptococcus pyogenes Using Strand Invasion Based Amplification (SIBA®) Method
Olli, Jenni (2017)
Olli, Jenni
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2017
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2017060211945
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2017060211945
Tiivistelmä
Tämän insinöörityön tavoitteena oli kehittää uusi ja nopea menetelmä Streptococcus pyogenesin tunnistamiseksi hyödyntäen Orion Diagnostican omistamaa isotermaalista nukleiinihappojen monistusmenetelmää SIBAa. S. pyogenes on ihmisen patogeeni, joka aiheuttaa satoja miljoonia nielutulehduksia vuosittain ympäri maailmaa. Lisäksi S. pyogenes aiheuttaa vakavia infektioita, kuten lihansyöjäbakteeri-infektiona tunnettua nekrotisoivaa faskiittia ja toksista sokkioireyhtymää. Nämä sairaudet vaativat nopeaa diagnosointia ja hoidon aloittamista mahdollisimman pian. S. pyogenes eli A-ryhmän streptokokki tunnistetaan yleensä viljelemällä bakteereita veriagarilla tai käyttämällä PCR-tekniikkaa.
Tämän insinöörityön toimeksiantajana oli Orion Diagnostica Oy ja työn kokeellinen osuus suoritettiin Orion Diagnostican tutkimus- ja tuotekehityslaboratoriossa. Kokeellinen osuus aloitettiin viljelemällä eri kantojen streptokokkeja veriagarilla. Kasvatettujen bakteerien genomiset DNA:t eristettiin ja kvantitoitiin hyödyntäen qPCR-tekniikkaa. Työssä käytetyt alukkeet ja keskioligo oli valmiiksi suunniteltu ja niiden yhteisvaikutuksia oli alustavasti tutkittu ennen tässä suoritetun osuuden aloitusta. Testimenetelmän kehitys aloitettiin seulomalla potentiaalisia LNA-koettimia. Tehokkaimmin toimivat alukeparit testattiin genomisella DNA:lla käyttäen myös potentiaalisinta LNA-koetinta. Kehitettyä testimenetelmää optimoitiin mm. titraamalla reaktiokomponentteja. Testimenetelmän herkkyys määritettiin ja lisäksi spesifisyys varmistettiin käyttämällä muita streptokokki-kantoja templaattina. Viimeiseksi tutkittiin kylmäkuivauksen vaikutusta kehitetyn testin toimintaan.
Insinöörityön aikana kehitettiin nopea metodi A-ryhmän streptokokin tunnistamiseksi. Testi osoittautui hyvin sensitiiviseksi ja jopa yksi molekyyli kohde-DNA:ta detektoitui. Kylmäkuivatuilla reagensseilla tehdyissä kokeissa kehitetty testi tunnisti A-ryhmän streptokokin 8,5 minuutissa. Aikataulusta johtuen testimenetelmän toimivuutta kokeiltiin vain genomisella DNA:lla eikä lainkaan kliinisillä näytteillä, kuten alun perin oli suunniteltu.
Työn aikana testimenetelmässä havaittiin epäspesifistä monistumista, ja tämä saattaa heikentää testin herkkyyttä. Testimenetelmän kehitystä tulisi jatkaa seulomalla lisää alukepareja ja keskioligoita, jolloin tavoitteena olisi löytää yhdistelmiä, joista aiheutuu vähemmän epäspesifistä monistumista. Toimivien yhdistelmien löydyttyä testi tulisi optimoida ja selvittää kuivauksen vaikutukset. Lisäksi testin toimivuus tulisi testata käyttäen kliinisiä näytteitä. Kliiniset näytteet sisältävät kohde-DNA:n lisäksi myös muita bakteereita ja ihmisen DNA:ta, ja nämä saattavat vaikuttaa testin toimintaan inhiboivasti.
Tämän insinöörityön toimeksiantajana oli Orion Diagnostica Oy ja työn kokeellinen osuus suoritettiin Orion Diagnostican tutkimus- ja tuotekehityslaboratoriossa. Kokeellinen osuus aloitettiin viljelemällä eri kantojen streptokokkeja veriagarilla. Kasvatettujen bakteerien genomiset DNA:t eristettiin ja kvantitoitiin hyödyntäen qPCR-tekniikkaa. Työssä käytetyt alukkeet ja keskioligo oli valmiiksi suunniteltu ja niiden yhteisvaikutuksia oli alustavasti tutkittu ennen tässä suoritetun osuuden aloitusta. Testimenetelmän kehitys aloitettiin seulomalla potentiaalisia LNA-koettimia. Tehokkaimmin toimivat alukeparit testattiin genomisella DNA:lla käyttäen myös potentiaalisinta LNA-koetinta. Kehitettyä testimenetelmää optimoitiin mm. titraamalla reaktiokomponentteja. Testimenetelmän herkkyys määritettiin ja lisäksi spesifisyys varmistettiin käyttämällä muita streptokokki-kantoja templaattina. Viimeiseksi tutkittiin kylmäkuivauksen vaikutusta kehitetyn testin toimintaan.
Insinöörityön aikana kehitettiin nopea metodi A-ryhmän streptokokin tunnistamiseksi. Testi osoittautui hyvin sensitiiviseksi ja jopa yksi molekyyli kohde-DNA:ta detektoitui. Kylmäkuivatuilla reagensseilla tehdyissä kokeissa kehitetty testi tunnisti A-ryhmän streptokokin 8,5 minuutissa. Aikataulusta johtuen testimenetelmän toimivuutta kokeiltiin vain genomisella DNA:lla eikä lainkaan kliinisillä näytteillä, kuten alun perin oli suunniteltu.
Työn aikana testimenetelmässä havaittiin epäspesifistä monistumista, ja tämä saattaa heikentää testin herkkyyttä. Testimenetelmän kehitystä tulisi jatkaa seulomalla lisää alukepareja ja keskioligoita, jolloin tavoitteena olisi löytää yhdistelmiä, joista aiheutuu vähemmän epäspesifistä monistumista. Toimivien yhdistelmien löydyttyä testi tulisi optimoida ja selvittää kuivauksen vaikutukset. Lisäksi testin toimivuus tulisi testata käyttäen kliinisiä näytteitä. Kliiniset näytteet sisältävät kohde-DNA:n lisäksi myös muita bakteereita ja ihmisen DNA:ta, ja nämä saattavat vaikuttaa testin toimintaan inhiboivasti.